一、前言

單細胞分析(Single-cell analysis)是研究單一細胞基因與蛋白質等生物分子的組成，以及其生理機制與型態，以瞭解組織中各個細胞之基因體、蛋白質體、轉錄體、對環境刺激的反應等差異，不但有助於胚胎與器官發育等基礎生物科學研究，亦能提升科學家對癌症等疾病的認識，包括了解疾病組織中細胞的異質性(heterogeneity)與組成，以及其對疾病發展的影響，進而改善疾病診斷與藥物的開發。

二、單細胞分析流程

單細胞分析流程涵蓋單細胞分離、樣本庫製備、單細胞定序、資訊分析等步驟，以下分別介紹前述步驟所採用之重要技術與趨勢。

(一) 單細胞分離(Single-cell isolation)
單細胞分離技術有助於觀察到單一顆細胞，甚至於可根據研究需求挑選特定表型和基因型的細胞。常見的單細胞分離技術包括：螢光活化細胞分選技術(Fluorescence-activated cell sorting, FACS，又稱為流式細胞分選技術)，以螢光標記欲分離的細胞，並透過流式細胞儀將帶有螢光之細胞分離出來，為目前最為廣泛使用的單細胞分離技術；雷射顯微擷取儀(Laser-capture microdissection)，利用雷射光將特定細胞從組織切片中擷取下來；磁珠標記細胞分選(Magnetic-activated cell sorting, MACS)，先利用磁珠標記特定細胞，再利用磁力將被標記的細胞分離出來；浮力細胞分選(Buoyancy activated cell sorting, BACS)，藉由離心機將不同浮力之細胞分離；微流體平台，具備高通量、可攜性、自動化、成本低等優勢，為近年發展的重心。

現有單細胞分離技術尚面臨著許多困難，包括螢光或磁珠等標記會影響細胞的活力；分離產量低；分離過程中難以維持細胞的活力；與後續的分析流程難以銜接等。另外，腦部等組織由於脂質含量高且脆弱，分離後細胞存活率低，同樣為目前待克服的挑戰。

(二) 單細胞樣本庫製備(Single-cell library preparation)
樣本庫製備為基因定序前的關鍵步驟。樣本庫品質(如基因片段長度一致性、雜質含量等)會嚴重影響後續定序與分析的準確度。細胞條碼(Cell barcoding)以及微流體裝置來目前樣本庫製備常採用的方法，例如10X Genomics公司開發的單細胞基因表現分析儀(Chromium Single Cell Gene Expression Flex)即採用先進的微流體技術，可自動化地將帶有細胞條碼的微珠(Gel Bead)與單顆細胞包覆於油滴中。細胞條碼含有獨特的核甘酸序列，能在後續基因定序時用以辨識基因的細胞來源。

未來樣本庫製備技術之發展方向將著重於簡化分析流程；開發樣本庫建立時使用的新型酵素；克服樣本擴增時，誤差與雜訊會一同放大(amplification bias)的挑戰等。

(三) 單細胞定序(Single-cell Sequencing)
單細胞定序為以次世代定序(NGS)技術為基礎，定序單顆細胞之DNA與RNA序列。此技術與體學(如蛋白質體分析)等其他技術搭配，能進一步分析單顆細胞的基因結構與蛋白質表現量，並且研究細胞間的差異性。例如：單細胞ATAC (Assay for Transposase Accessible Chromatin)定序，能夠找出細胞染色體中DNA裸露的區域(此區域的DNA才能進行轉錄)；單細胞轉錄體定序(亦稱為Single cell RNA Sequencing, scRNA-seq)，能測量細胞中正在進行轉錄的基因片段與其表現量。

代表性公司有Illumina、Mission Bio、PacBio等。Illumina開發出NextSeq 1000 和2000等為廣泛被使用的單細胞定序平台；Mission Bio 推出的Tapestri 平台特色為能同時分析細胞基因型和表現型；PacBio推出的HiFi定序技術能夠精準地定序長基因片段，有助於基因序列變異與細胞異質性的研究。

降低雜訊，以提高定序精準度為此類技術待克服的重要挑戰。預計隨著空間基因體學(Spatial genomics)、活體單細胞定序等技術的發展，未來將能夠提升單細胞定序的數據品質。

(四) 單細胞生物資訊學(Single-cell Bioinformatics)
單細胞定序會產生龐大的數據，因此需要功能強大的分析工具來處理前述數據，尤其是近年來多體學技術的迅速發展，更是加劇了數據分析的複雜度，如探討細胞基因型與表型的關聯。然而目前相關分析工具尚未發展成熟，且多需要具備數據科學之專業人員才能有效掌握。隨著人工智慧技術的發展，未來可望能大幅度簡化數據分析難度，並能迅速提供有價值的見解，包括比較各類型的實驗結果與基因序列，找出新的藥物標靶。

代表性案例有BioTuring、Chan Zuckerberg Initiative等。BioTuring開發出的BBrowserX能夠幫助研究人員快速且輕鬆地分析和視覺化大量單細胞數據，如自動分析樣本中的細胞類型與比例、從細胞資料庫挑出有相似基因體的細胞；Chan Zuckerberg Initiative推出的CZ CellxGene，則擁有超過3500萬種細胞的標準化基因數據，以及大量健康小鼠與人體組織的標準化資訊，能幫助科學家迅速找出細胞的功能。

三、新興單細胞分析技術

近期人工智慧技術、空間體學(Spatial Omics)、微流體等技術之進展，為支持單細胞分析技術發展與創新的關鍵(前述技術介紹請參閱圖一)。以下介紹兩項新興單細胞分析技術。

(一) 活體細胞定序(Live-cell Sequencing)
過去細胞定序需先破壞細胞後，才能將細胞的DNA或RNA取出定序。然而，此種方式就無法持續觀察同一細胞在受到刺激後的反應，以及基因表現的轉變。活體細胞定序能夠在不破壞及殺死細胞之情況下，獲得細胞基因表現等資訊。Cytosurge結合了微流體技術與原子力顯微鏡(AFM)，開發出創新的流體力顯微鏡(Fluidic Force Microscopy, FluidFM)，研究人員可以透過此顯微鏡上帶有微流道的探針，能從活體細胞中收集微量含有mRNA的樣品進行後續分析。

(二) 3D基因體(3D genome)
基因體的三維結構是複雜、動態的，且對於基因調控至關重要。染色體結構捕捉技術(3C, Chromosome Conformation Capture)、創新顯微鏡技術等3D基因體技術能用以研究基因體在細胞內運作、調控，或分析細胞內不同區域基因體交互作用，幫助科學家更明瞭細胞基因體的調控機制以及異質性。Single Technologies利用先進的微流體與共軛焦顯微鏡技術，開發出創新3D定序儀Theta，能夠直接在完整的生物樣本中進行定序，並且定位基因表現的空間位置。

四、發展趨勢觀察

(一) 擴張應用範疇
近年來，單細胞定序產品與平台持續增加，單細胞定序適用的疾病領域也逐漸擴張至腫瘤學、產前檢測、腦部疾病研究等領域。在腫瘤學方面，單細胞分析有助於理解腫瘤的異質性，以及腫瘤微環境對於癌症發展的影響。預計隨著技術逐漸成熟，單細胞分析將會成為癌症診斷與預後預測之重要工具。在產前檢測方面，單細胞分析能提供精準的胚胎基因檢測結果，包括識別基因突變、遺傳性疾病，有助於醫師挑選最合適的胚胎。在腦部疾病研究方面，人類大腦的組成非常複雜，不同的神經元具備不同的型態、連結與電生理特性，因此在分析不同神經細胞的功能，以及辨識正常與患病神經細胞之間的差異面臨著挑戰。目前研究人員正嘗試使用單細胞分析來分析神經退化性疾病的腦細胞差異。

(二) 提升單細胞分析技術之空間解析度與分析能力
目前單細胞分析正朝向空間體學發展，3D基因體等技術之空間解析度亦逐漸提升至亞細胞層級。未來發展方向除了進一步提升解析度以及提高單次實驗能分析的細胞數量之外，結合微流道等先進技術，簡化分析流程並且減少樣品損失；開發自動化與標準化流程與設備，以降低分析成本；或者採用人工智慧技術，從多個層面分析數據並提供見解等，皆是單細胞分析技術日後進入臨床應用的關鍵。

五、創新案例

(一) 能維持脆弱細胞活性的細胞分離平台- HIVE CLX
開發商：Honeycomb Biotechnologies
Honeycomb推出先進的檢體儲存及單細胞分離平台-HIVE CLX。此平台能簡化單細胞分離與保存，包括嗜中性球等難以保存的細胞、體積大但脆弱的肝臟細胞，使檢體得以能夠被安全的運送至檢驗單位，並可消除因檢驗時間不同產生的誤差。另外，Honeycomb亦推出以AI演算法為基礎的分析軟體，能迅速分析單細胞定序的結果，並且能同時處理多個樣本，可大幅簡化基因分析所需的時間。

(二) 可用以研究腫瘤異質性的高解析度空間單細胞蛋白質體學平台
開發商：Navignostics AG
Navignostics AG推出了具備高空間解析度的單細胞蛋白質體學平台，可用以瞭解腫瘤異質性及微環境差異。Navignostics AG已開發出多樣(超過40種)且具專一性的獨特抗體來對癌細胞染色，並透過成像質譜流式細胞系統(imaging mass cytometry system)拍攝出高解析的細胞類型、蛋白質濃度、細胞交互作用等影像。另外，Navignostics亦透過自動化，簡化實驗與分析流程，同時確保資料收集與評估的一致性。

(三) 單細胞多體學數據分析平台-ScaiVision
開發商：Scailyte
Scailyte推出以人工智慧為基礎的單細胞多體學數據分析平台ScaiVision。此平台能夠從少量的細胞中識別出具有成為藥物標靶潛力的蛋白質區域，並且能整合蛋白質體、基因體學等體學數據，以及疾病進展、嚴重程度、治療反應等臨床資訊進行分析，預測藥物治療效果，有助於縮短新藥開發的時間並降低成本。