一、病毒載體產品生產製造之主要挑戰

細胞與基因療法(Cell and gene therapy, CGT)常以病毒作為輸送治療基因的載體，因此病毒載體(Viral vector)的生產製造為細胞與基因療法發展與普及之關鍵。病毒載體產品生產流程可簡單分成宿主細胞(Host Cell)培養與病毒載體生產等上游製造程序，以及病毒載體純化(Purification)、最終的配方與灌裝(Formulation and Filling)等下游製造程序。目前在生產病毒載體面臨的重要挑戰包含生產效率、產品批次間品質控管、生產量能、原料供應及生產成本等幾個面向，例如宿主細胞(Host Cell)培養以及將遺傳物質引入細胞的轉染技術(Transfection)仍無法滿足大規模生產之需求；傳統的人工操作模式與開放式的培養系統，以及標準化分析和檢測機制的缺乏，對產品品質維持有相當高的難度；此外，昂貴的原材料與生產設備，以及量產技術升級的投資需要，導致現有病毒載體的生產成本居高不下。

二、具潛力之解決方案與相關新興技術

以下聚焦於宿主細胞(Host Cell)培養、轉染技術、病毒載體純化以及分析與檢測工具等四項關鍵生產流程，簡述各流程面臨的主要瓶頸，以及相對應的新興技術與具潛力之解決方案。

(一) 宿主細胞(Host Cell)之培養程序開發
細胞培養可依據是否須貼附在支持物的表面上生長，區分為貼附型培養(Adherent Cultures)和懸浮型培養(Suspension Cultures)兩大類。大多數細胞屬於貼附型，並不適合於大型生物反應器培養(可貼附的表面有限)，且有難以蒐集的缺點，嚴重限制了細胞產量。為了克服低產量的問題，業者正朝向開發能適應於懸浮型培養的細胞株，以在生物反應器中大規模繁殖。此外，多種懸浮型細胞(如HEK-293T細胞與草地貪夜蛾Sf9細胞)具有在以化學試劑與蒸餾水配製而成的合成培養基中成長之特性，不須額外的動物來源添加物(如牛血清)，可避免添加物不同批次的品質差異，干擾細胞的產量與表現，對於品質管控有相當大的助益。
另外，調節懸浮型細胞特定基因(例如細胞貼附基因)表現，可能有助於提升懸浮型細胞培養與純化程序之效率，因此操縱細胞內的調節網絡以提高產量，亦為具發展潛力的新興技術之一。

(二) 提高轉染效率(Transfection Efficiencies)
先進的轉染技術以及穩定的細胞株有助於提高轉染效率，降低生產製造成本。短暫轉染(Transient transfection)為目前快速生產病毒載體主要採用的轉染技術，且又以三質體(plasmid，小型環狀且具有自我複製能力之DNA分子)轉染最為常見。近期科學家持續朝向先進轉染技術研發(例如四質體轉染等)，以優化轉染效率，並降低病毒遺傳物質發生重組進而產生致病能力的風險。然而，由於短暫轉染使用的質體，並不會插進宿主的染色體中，僅能於細胞質中存活短暫的時間，數天之後須重新轉染，因此在質體的高成本與供應量不足的限制下，轉染技術目前仍無法完全滿足病毒載體生產之需求。
另一方面，具有可持續擴增、可重複使用以及可持續生產病毒載體的穩定細胞株，為轉染技術突破的潛力解決方案。持續生產代表不需要重複轉染，能省去持續提供質體的昂貴成本，同時也避免了轉染過程中的可能汙染。然而，持續擴增通常也意味著永生，因此該類細胞株的產物可能對人體基因有著不可忽視的潛在風險(如致癌)。

(三) 病毒載體之純化 (Purification)
病毒載體純化需經過澄清(Clarification)、捕捉/濃縮(Capture/Concentration)等多項步驟。澄清為將細胞裂解後，利用離心或過濾等方式將病毒載體與雜質(如細胞碎片)分離。傳統實驗室多以離心法來分離病毒載體，但由於離心設備成本高且操作費時，不適合商業化量產。深層過濾(Depth filter)及濾膜過濾(Membrane filter)等過濾法已逐漸被廣泛應用於病毒載體純化，例如近期研究發現利用矽藻土能縮短慢病毒(Lentivirus)載體過濾所需的時間。
至於捕捉/濃縮(Capture/Concentration)步驟，陰離子交換層析法(Anion exchange chromatography, AEX)為病毒載體量產主要採取的技術手段，然而如何減少病毒流失，並且提高回收率(recovery yield)，為該步驟待突破之瓶頸。層析材料的改進，為可能的解決方向，例如奈米纖維(Nanofiber)與其他材料(如可與病毒載體親合之配體)的搭配，能提高病毒載體的捕捉效率，降低層析所需的時間，甚至可簡化純化所需的步驟，以減少各步驟間的產量損失，具有取代傳統層析材料(如樹脂)之潛力。

(四) 新興分析與檢測工具
完善的分析及檢測工具能確認產品特性與維持品質，不但有利於病毒載體生產，對於後續CGT之製程管控皆有所助益。目前主流的分析檢測工具有：檢驗產品雜質的層析法(Chromatography)；定量病毒載體與檢測基因體的微滴式數位聚合酶連鎖反應 (droplet digital PCR, ddPCR)與定量聚合酶連鎖反應 (quantitative PCR, qPCR)；確認病毒載體濃度與蛋白質汙染的免疫學方法；量測顆粒大小及聚集程度的動態光散射(Dynamic Light Scattering, DLS)技術等。然而現有技術普遍有著低通量、耗時、不穩定性高以及無自動化等缺點。另外，由於病毒種類與型態眾多，若針對各類病毒載體開發不同的分析方法不符合成本效益。因此，快速、準確、自動化以及可適用於不同病毒載體之新興檢測方法，為業者近期重點投入方向，Biogen、Amgen、Roche等國際製藥大廠與相關的CDMO公司亦正積極建構強大而靈敏的分析工具。
新興的分析與檢測工具包括離子交換高效液相層析(Ion exchange-high-performance liquid chromatography, IEX-HPLC)，能夠快速且即時對病毒衣殼(Capsid)進行定量；即時在線監測(In-line Monitoring)與分析系統，以即時優化生產流程和管控品質。

三、結語

有鑑於細胞與基因療法之市場需求逐步增加，強化產能、提高製程效率等將是未來發展趨勢。Frost & Suliivan認為包括以即插即用平台(Plug and Play Platform)優化製造流程、運用一次性製程(Single Use Technologies)提高產線運用靈活度、即時數據分析(Process Analytical Technology)提高製程效率，以及運用程序強化(Process Intensification)實現連續製造等，詳見圖一，將是製藥產業具潛力之技術發展項目。